УДК 581.1
ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ ЛИПИДОВ КАЛЛУСОВ ДВУХ ВИДОВ СОСНЫ Pinus sibirica И Pinus sylvestris
© 2010 г. С. П. Макаренко, Ю. М. Константинов, В. Н. Шмаков,
Т. А. Коненкина
Учреждение Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск
Поступила в редакцию 21.05.2010 г.
Изучен жирнокислотный (ЖК) состав липидов каллусов хвои двух видов сосны: сибирской (Pinus sibirica Du Tour) и обыкновенной (P. sylvestris L.). ЖК-состав липидов каллусов характеризовался высоким содержанием ненасыщенных ЖК: для сосны сибирской – 81.7% и для сосны обыкновенной – 63.2%, главными из которых были олеиновая и линолевая кислоты (22.9 и 34.0% от суммы ЖК у P. sibirica и 17.6 и 27.8% у P. sylvestris соответственно). В липидах каллусов также в значительном количестве содержались ∆5-UPIFA (ненасыщенные полиметилен-разделенные ЖК), главными из которых были пиноленовая и скиадоновая. Сравнение ЖК-состава липидов каллусов хвои сосны обыкновенной и фотосинтезирующих тканей хвои этого же вида показало, что первые отличались бóльшим разнообразием Δ5-UPIFA по сравнению с липидами хвои, но меньшим уровнем ненасыщенности ЖК, а также более высоким уровнем ∆5-UPIFA.

Ключевые слова:Pinus sibirica – Pinus sylvestris   каллусы – жирные кислоты   ∆5-UPIFA


Сокращения: АПБ   ацил-переносящий белок; ИН – индекс ненасыщенности; LDR – линолеоил-десатуразное отношение; ODR – олеоил-десатуразное отношение; PUFA – полиненасыщенные ЖК; Δ5-UPIFA   ненасыщенные полиметилен-разделенные ЖК.
Адрес для корреспонденции: Макаренко Сергей Петрович. 664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: 007 (395) 251-07-54; электронная почта: makar@sifibr.irk.ru


ВВЕДЕНИЕ
    
     Исследование жирнокислотного (ЖК) состава липидов клеточных мембран высших растений представляет значительный интерес в связи с той исключительно важной ролью, которую играют длинноцепочечные ЖК как в структурно-функциональной организации клеточных мембран, так и в процессах клеточного метаболизма. Состав и структура насыщенных и ненасыщенных ЖК в мембранных липидах позволяет получать информацию о наличии и активности мембранных десатураз, катализирующих введение двойной связи в углеводородную цепь ЖК [1, 2]. У большинства видов высших растений в ходе биосинтеза ненасыщенных ЖК введение первой двойной связи в цис-9-положение молекулы осуществляется растворимой стеароил-АПБ (ацил-переносящий белок) десатуразой [3, 4]. Введение второй и третьей двойных связей в ненасыщенные ЖК с 18 углеродными атомами в хлоропластных мембранах осуществляется с участием мембранных ацил-липидных ω6- (Fad5 и Fad6) и ω3- (Fad7 и Fad8) десатураз [5, 6]. В нефотосинтезирующих тканях растений (семенах, корнях) образование полиненасыщенных ЖК (PUFA) происходит с участием ацил-липидных ω6- (Fad2) и ω3- (Fad3) мембранных десатураз эндоплазматического ретикулума [2, 7, 8]. В ЖК-составе липидов, выделенных из семян и хвои различных видов сосны и других хвойных пород, идентифицированы Δ5-ненасыщенные ЖК с нерегулярным положением двойных связей (Δ5-UPIFA), такие как Δ5,9-С18:2 (таксолеиновая), Δ5,9,12-С18:3 (пиноленовая), Δ5,9,12,15-18:4 (конифероновая), Δ5,11,14-С20:3 (скиадоновая) и другие [9, 10]. Десатурация длинноцепочечных Δ5-ненасыщенных ЖК в липидах растений, животных и грибов связана с цитохромом b5, который в виде домена включается в состав Δ5-десатуразы либо с N-концевой части аминокислотной последовательности фермента, либо с ее С-концевой части [11–13]. Рассмотрение функциональных характеристик Δ4-, Δ5-, Δ6- и Δ8-десатураз или front-end десатураз, включаемых в биосинтез ненасыщенных ЖК с тремя и более двойными связями, показывает, что Δ5-десатураза в липидах клеток животных, грибов, микроводорослей, мхов и лишайников принимает участие в биосинтезе арахидоновой (С20:4Δ5,8,11,14) и эйкозапентаеновой (С20:5Δ5,8,11,14,17) кислот [14–17]. В настоящее время трудно объяснить присутствие Δ5-UPIFA в значительных количествах в липидах фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих тканей некоторых видов растений. Предполагается, что изменения в содержании Δ5-UPIFA в липидах семян хвойных могут быть связаны с их устойчивостью к низким температурам [9, 10]. Изучение Δ5-UPIFA у разных видов хвойных растений также связано с их использованием в исследованиях по хемосистематике и реконструкции филогенетических взаимоотношений различных таксонов [9, 18]. Другим важным аспектом исследования ∆5-ненасыщенных ЖК в липидах семян хвойных видов является их использование в медицине как противовоспалительных и противоопухолевых соединений [15, 19, 20].
     Несмотря на большое внимание, уделяемое в настоящее время изучению мембранных липидов растительной клетки, многие вопросы липидного обмена у растений остаются малоизученными. Одним из перспективных подходов в решении этих вопросов может быть получение и использование культур клеток in vitro, являющихся важным инструментом в физиолого-биохимических исследованиях. В связи с недостаточностью сведений относительно ЖК липидов мембран клеток у таких представителей хвойных, как сосна сибирская (Pinus sibirica) и сосна обыкновенная (P. sylvestris), представлялось важным изучить у них ЖК-состав клеточных липидов, и особенно Δ5-UPIFA, в полученных из хвои каллусных культурах. Такие кислоты, как пиноленовая, скиадоновая и юнипероновая, представляют большой интерес в связи с их использованием в фармакологии и медицине как противовоспалительных и противоопухолевых соединений, в диетологии и пищевых добавках [15, 19, 20].
     Целью настоящей работы было изучение ЖК липидов каллусов, полученных из хвои двух видов сосны P. sibirica и P. sylvestris.
    
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    
     Для инициации и субкультивирования каллусных культур Pinus sibirica Du Tour и P. sylvestris L. использовали среду следующего состава: макро- и микросоли по Murashige и Skoog [21] с добавлением 0.4 мг/л тиамина (“Sigma”, США), 0.1 мг/л пиридоксина, 0.5 мг/л никотиновой кислоты, 100 мг/л инозита (“Sigma”), 200 мг/л гидролизата казеина и 20 г/л сахарозы. (“Мосреактив”, Россия). В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д (1 мг/л) и БАП 0.1 мг/л (“Sigma”) [22]. Экспланты и полученные из них каллусы культивировали в темноте при постоянной температуре 25”С. В экспериментах использовали ветви нижней трети кроны длиной примерно 3п4 см с хвоей. Процедура стерилизации включала следующие этапы: обработка материала 3% раствором перекиси водорода в течение 5 мин, выдерживание 15 мин в 25% растворе коммерческого средства Доместос-гель; трехкратная отмывка в стерильной дистиллированной воде. В качестве эксплантов из хвои P. sibirica и P. sylvestris использовали только проксимальную часть хвои размером до 1 см, которую помещали на среду горизонтально.
     Образцы каллусов, полученные от различных деревьев, растирали в агатовой ступке до однородной массы в хлороформе. Полученный гомогенат переносили в делительную воронку объемом 10 мл и экстрагировали липиды смесью хлороформ : метанол : вода (1 : 2 : 0.8) [23]. Для получения метиловых эфиров ЖК [5] к экстракту липидов после удаления растворителя добавляли 1% метанольный раствор Н2SO4 и нагревали на водяной бане при 60 С в течение 30 мин. После охлаждения к полученной смеси добавляли воду до 1/2 объема смеси и трижды экстрагировали метиловые эфиры ЖК гексаном. Анализ метиловых эфиров ЖК каллусных культур проводили с использованием хроматомасс-спектрометрa Agilent technology 5973N/6890N MSD/DS (США); капиллярная колонка – HР-Innowax (30 м м 250 мкм   0.50 мкм), 260мС, газ носитель – гелий, скорость – 1 мл/мин. Для идентификации метиловых эфиров ЖК использовали данные, полученные нами ранее для ЖК липидов хвойных [17] и библиотеки масс-спектров.
     Для оценки ненасыщенности ЖК в липидах каллусных культур использовали индекс ненасыщенности: ИН = ∑РJ/100, где РJ содержание (вес. %) ненасыщенных ЖК, умноженное на число двойных связей в каждой кислоте [24]. Эффективную активность мембранных ацил-липидных ω6- и ω3-десатураз, участвующих в биосинтезе линолевой и α-линоленовой кислот, определяли из процентного содержания олеиновой, линолевой и α-линоленовой кислот, как олеоил-десатуразное (ODR) и линолеоил-десатуразное (LDR) отношения (уравнения 1 и 2) [25]:
     ODR = (%C18:2 + %С18:3)/(%C18:1 + %C18:2 + %C18:3);  (1)
     LDR = (%C18:3)/(%C18:2 + %C18:3).     (2)
     В таблице представлены средние данные из 3 биологических повторностей и их стандартные отклонения. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (P < 0.05).
    
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    
     Экспланты и полученные из них каллусы культивировали в темноте при постоянной температуре 25ЭС. ЖК-состав липидов каллусов хвои для двух видов сосны показан в таблице. Как видно из полученных данных, доля ненасыщенных ЖК в липидах каллусов P. sibirica и P. sylvestris составляла 81.7 и 63.3% от суммы ЖК соответственно. Среди насыщенных ЖК липидов каллусов обоих видов преобладала пальмитиновая (С16:0) кислота − 13.5 и 24.4% у P. sibirica и P. sylvestris соответственно; также идентифицировали миристиновую, пентадекановую, маргариновую, стеариновую, арахиновую, бегшеновую, трикозановую и лигноцериновую кислоты, присутствовавшие в незначительных концентрациях. В составе ненасыщенных ЖК липидов каллусов были идентифицированы моно-, ди-, три- и тетраеновые ЖК с цис-конфигурацией двойных связей (таблица). В группе моноеновых ЖК липидов каллусов из хвои двух изученных видов сосны главной была олеиновая (С18:1∆9) кислота, доля которой составляла 22.9 и 17.5% от суммы ЖК соответственно, остатки которой служат субстратом для биосинтеза полиненасыщенных ЖК, а также и для биосинтеза Δ5-UPIFA в мембранах растений [9, 10, 14]. Помимо олеата в липидах каллусов обоих видов сосны также идентифицировали другие минорные моноеновые ЖК − гексадеценовые (ω5-, ω7- и ω9-16:1), цис-вакценовую (ω7-18:1) и гадолеиновую (ω9-С20:1) кислоты.
     Анализ ЖК-состава липидов каллусов показал, что в составе PUFA можно выделить две группы ЖК, биосинтез которых проходит эукариотическим путем. Одна – с образованием ЖК с регулярным положением цис-двойных связей в углеводородной цепи с участием ацил-липидных ω6- и ω3-десатураз, и другая – с образованием Δ5-ненасыщенных полиметилен-разделенных ЖК (Δ5-UPIFA). Так, в составе “регулярных” PUFA липидов каллусов сосны преобладала линолевая кислота, содержание которой у P. sibirica составляло 34.0% от суммы ЖК, а у P. sylvestris − 27.8%. Уровень α-линоленовой кислоты в липидах каллусов P. sibirica был более, чем вдвое выше, чем у P. sylvestris (9.3 и 4.0% соответственно), что отражалось и на величинах десатуразных соотношений, характеризующих активность ацил-липидных ω6- и ω3-десатураз. Так, в каллусах обоих видов сосны активность ацил-липидной ω-6-десатуразы была примерно на одном и том же уровне (ODR = 0.654 и 0.644 соответственно), тогда как линолеатные десатуразные соотношения у этих каллусов различались почти в 2 раза (LDR = 0.214 и 0.127), что свидетельствовало о более интенсивном биосинтезе α-линоленовой кислоты в каллусах P. sibirica по сравнению с каллусами P. sylvestris.
     Для сравнения мы проанализировали также ЖК липидов хвои P. sylvestris. Как видно из таблицы, как качественный, так и количественный ЖК-состав липидов хвои и каллусов был различен. Так, липиды каллусов отличались бóльшим разнообразием Δ5-UPIFA по сравнению с липидами хвои, но меньшим уровнем ненасыщенности ЖК (ИН = 1.14 и 1.97 соответственно). Величина ИН последних была выше вследствие значительно более высокого содержания в них α-линоленовой кислоты и других PUFA, а также присутствия С16- и С20-полиненасыщенных ЖК, отсутствующих в липидах каллусов. На более высокую по сравнению с каллусами активность десатураз в фотосинтезирующих тканях P. sylvestris указывают и величины ODR и LDR (см. таблицу), что обусловлено высокой экспрессией генов fad7 и fad8 ω3-десатуразы в хлоропластных мембранах. Близкие результаты были представлены в работе [26], посвященной изучению ЖК липидов хвои сосны обыкновенной, где в контрольных образцах ИН составлял 2.1.
     Одним из важных признаков, характеризующих липиды каллусов и хвои сосны изученных видов, является присутствие в них нескольких видов ∆5-UPIFA, концентрация которых в липидах хвои достигала 22.4% от суммы ЖК. Главной из этих ЖК в липидах как каллусов, так и хвои была скиадоновая кислота, доля которой в липидах каллусов P. sibirica была в 1.6 раза выше, чем у P. sylvestris (6.3 и 3.9% от суммы ЖК соответственно), а в липидах хвои P. sylvestris относительное содержание этой ЖК превышало ее концентрацию в каллусах почти в 2.5 раза. Другими ∆5-UPIFA в липидах хвои были пиноленовая, конифероновая и юнипероновая ЖК.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.  Shanklin J., Cahoon E. Desaturation and Related Modifications of Fatty Acids // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 611R649.
2.  Tocher D.R., Leaver M.J., Hodgson P.A. Resent Advances in the Biochemistry and Molecular Biology of Fatty Acyl Desaturase // Prog. Lipid Res. 1998. V. 37. P. 73.117.
3.  Slocombe S.P., Piffanelli P., Fairbairn D., Bowra S., Hatzopouos P., Tsintis M., Murphy D. Temporal and Tissue-Specific Regulation of a Brassica napus Stearoyl-Acyl Carrier Protein Desaturase Gene // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 1167P1176.
4.  Schultz D.J., Suh M.C., Ohlrogge J.B. Stearoyl-Acyl Carrier Protein and Unusual Acyl-Acyl Carrier Protein Desaturase Activities Are Differentially Influenced by Ferredoxin // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 681 692.
5.  Miquel M., Browse J. Arabidopsis Mutants Deficient in Polyunsaturated Fatty Acid Synthesis. Biochemical and Genetic Characterization of a Plant Oleoyl-Phosphatidylcholine Desaturase // J. Biol. Chem.1992. V. 267. P. 1502.1509.
6.  Martz F., Kivinlemi S., Palva T.E., Sutinen M.-L. Contribution of ω-3 Fatty Acid Desaturation and 3-Ketoacyl-ACP Synthase II (KASII) Genes in the Modulation of Glycerolipid Fatty Acid Composition during Cold Acclimation in Birch Leaves // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 897u909.
7.  Okuley J., Lightner J., Feldman K., Yadov N., Lark E. Arabidopsis Fad2 Gene Encodes the Enzyme That Is Essential for Polyunsaturated Lipid Synthesis // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1476158.
8.  Qi B., Fraser T., Mugford S., Dobson G., Sayanova O., Butler J., Napier J.A., Stobart A.K., Lazarus C.M. Production of Very Long Polyunsaturated ω-3 and ω-6 Fatty Acid in Plants // Nat. Biotech. 2004. V. 22. P. 739 745.
9.  Wolff R.L., Lavialle O., Pedrono F., Pasquier E., Delus L., Marpeau A.M., Aitzetmuller K. Fatty Acid Compositions of Pinaceae as Taxonomic Markers // Lipids. 2001. V. 36. P. 439o451.
10.  Mongrand S., Badoc A., Patouille B., Lacomblez C., Chavent M., Cassagne C., Bessoule J.-J. Taxonomy of Gymnospermae: Multivariate Analyses of Leaf Fatty Acid Composition // Phytochemistry. 2001. V. 58. P. 101 115.
11.  Napier J.A., Sayanova.O., Sperling P., Heinz E.A. A Growing Family of Cytochrome b5-Domen Fusion Proteins // Trends Plant Sci. 1999. V. 4. P. 2-4.
12.  Itoh R., Toda K., Takahashi H., Takano H., Kuroiwa T. Δ-9 Fatty Acid Desaturase Gene Containing a Carboxyl-Terminal Cytochrome b5 Domain from the Red Alga Cyanidioschyzon merolae // Curr. Genet. 1998. V. 33. P. 165/170.
13.  Stukey J.E., McDonough V.M., Martin C.E. The OLE1 Gene of Saccharomyces cerevisiae Encodes the Δ9 Fatty Acid Desaturase and Сan Be Functionally Replaced by the Rat Stearoyl-CoA Desaturase Gene // J. Biol. Chem. 1990.V. 265. P. 20 144120 149.
14.  Sayanova O., Haslam R., Venegas-Caleron M., Napier J.A. Cloning and Characterization of Unusual Fatty Acid Desaturases from Anemone leveillei: Identification of an Acyl-Coenzyme A C20e5-Desaturase Responsible for the Synthesis of Sciadonic Acid // Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 445-467.
15.  Kajikawa M., Yamato K.T., Kohzu Y., Shoji S., Matsui K., Tanaka Y., Sakai Y., Fukuzawa H. A Front-End Desaturase from Chlamydomonas reinhardtii Produces Pinolenic and Coniferonic Acids by ω13 Desaturation in Methylotrophic Yeast and Tobacco // Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. P. 64.73.
16.  Tonon T., Sayanova O., Michaelson L.V., Qing R., Harvey D., Larson T.R., Li Y., Napier J.A., Graham I.A. Fatty Acid Desaturase from the Microalga Thalassisira pseudonana // FEBS J. 2005. V. 272. P. 3401/3412.
17.  Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Путилина Т.Е., Донская Л.И., Музалевская О.В. Жирнокислотный состав липидов эндосперма и зародыша семян Pinus sibirica и Pinus sylverstris // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 480.485.
18.  Wolff R.L., Comps B., Marpeau A.N., Deluc L.G. Taxonomy of Pinus Species Based on the Seed Oil Fatty Acid Compositions // Trees. 1997. V. 12. P. 113e118.
19.  Pasman W.J., Heimerikx J., Rubingh C.M., van den Berg R., O΄Shea M., Gambelli L., Hendriks H.F., Einerhand A.W., Scott C., Keizer H.G., Mennen L.I. The Effect of Korean Pine Nut Oil on In Vitro CCK Release, on Appetite Sensations and on Gut Hormones in Postmenopausal Overweight Women // Lipids Health Dis. 2008. V. 7. doi: 10.1186/1476-511X-7-6.
20.  Morishige J., Amano N., Hirano K., Nishio H., Tanaka T., Satouchi K. Inhibitory Effect of Juniperonic Acid ( -5c,11c,14c,17c-20:4, --3) on Bombesin-Induced Proliferation of Swiss 3T3 Cells // Biol. Pharm. Bull. 2008. V. 31. P. 1786 1789.
21.  Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473 497.
22.  Шмаков В.Н., Константинов Ю.М. Использование культуры клеток in vitro для изучения генетического разнообразия у Pinus sibirica du Tour в условиях лесосеменной плантации // Сиб. экол. журн. 2004. № 2. C. 1492155.
23.  Bligh E.G., Dyer W.J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. P. 911a917.
24.  Lyons J.M., Wheaton T.A., Pratt Y.K. Relationship between the Physical Nature of Mitochondrial Membranes and Chilling Sensitivity in Plants // Plant Physiol. 1964. V. 39. P. 2622268.
25.  Cartea M.E., Migdal M., Galle A.M., Pelletier G., Guerche P. Comparison of Sense and Antisense Methodologies for Modifying the Fatty Acid Composition of Arabidopsis Oilseed // Plant Sci. 1998. V. 136. P. 181.194.
26.  Чернобровкина Н.П., Дорофеева О.С., Ильинова М.К, Робонен Е.В., Верещагин А.Г. Жирнокислотный состав суммарных липидов хвои сеянцев сосны обыкновенной в связи с обеспеченностью бором // Физиология растений. Т. 55. 2008. C. 404.411.