УДК 581.1
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ КАРБОАНГИДРАЗЫ Cah3 В ТИЛАКОИДНОЙ МЕМБРАНЕ ХЛОРОПЛАСТА И ПИРЕНОИДА Chlamydomonas reinhardtii
© 2009 г. А. Г. Маркелова, М. П. Синетова, Е. В. Куприянова, Н. А. Пронина
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 12.09.2008 г.


Исследовали локализацию люменной карбоангидразы Cah3 в тилакоидных мембранах Chlamydomonas reinhardtii дикого типа и фотосинтетических мутантов с различным составом хлорофилл–белковых комплексов фотосистем, а также фотосинтетические характеристики C. reinhardtii дикого типа и мутанта cia3, лишенного активной формы карбоангидразы Cah3. С помощью вестерн-блот-анализа показано отсутствие кросс-реакции с антителами к Cah3 у мутанта, лишенного реакционного центра ФС II, в отличие от мутанта, лишенного ССК ФС II. Эти данные показывают, что люменная Cah3 ассоциирована с полипептидами на донорной стороне реакционного центра ФС II. С помощью иммуноэлектронной микроскопии и с использованием антител к Cah3 из C. reinhardtii впервые показали, что Cah3 преимущественно локализована в тилакоидах пиреноида, в котором находится основная доля Rubisco. Скорость фотосинтетического выделения кислорода и фотохимическая эффективность ФС II у мутанта C. reinhardtii cia3 были ниже по сравнению с диким типом, особенно в клетках, выращенных при недостатке СО2, что свидетельствует об участии Cah3 в СО2-концентрирующем механизме хлоропласта. Полученные данные подтверждают нашу гипотезу [1, 2], что реакция карбоксилирования у микроводорослей происходит в особом Rubisco-содержащем участке хлоропласта – пиреноиде, куда СО2 проникает из люмена внутрипиреноидных тилакоидов. Обсуждается функциональная значимость пиреноида как самостоятельного метаболического микрокомпартмента, в котором Cah3 играет ключевую роль в образовании и концентрировании СО2 для Rubisco, что может вносить существенный вклад в увеличение эффективности фотосинтеза за счет эффективного вовлечения СО2 в цикл Кальвина.
-------------------------
Сокращения: КА – карбоангидраза; ССМ – СО2-концентрирующий механизм.
Адрес для корреспонденции: Пронина Наталия Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул. 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта:

pronina@ippras.ru

Ключевые слова: Chlamydomonas reinhardtii – фотосинтетические мутанты – ССМ-мутант cia3 – локализация тилакоидной карбоангидразы Cah3 – ФС II – пиреноид – иммуноэлектронная микроскопия.

ВВЕДЕНИЕ

Отличительной особенностью многих эукариотических микроводорослей является

наличие в хлоропласте крупных белковых комплексов – пиреноидов, природа

которых имеет большое сходство с карбоксисомами цианобактерий. На

электронных микрофотографиях пиреноид выглядит как электронно-плотное

включение в хлоропласте, окруженное у многих видов водорослей крахмальной

обкладкой. Тилакоиды хлоропласта пронизывают или частично погружаются в

белковый матрикс пиреноида в случайном или организованном порядке [3, 4].
Морфологию пиреноидов исследовали на протяжении многих лет, тогда как его

функциональная роль до сих пор остается неясной. Начиная с 90-х годов

прошлого века, несколько фактов позволили сделать предположение относительно

возможного функционирования пиреноида как самостоятельного метаболического

микрокомпартмента. Во-первых, было установлено, что пиреноид так же, как

карбоксисомы цианобактерий, содержит значительную, если не всю Rubisco

клетки [3, 5]. Во-вторых, было показано участие Rubisco в формировании

пиреноидов в клетках микроводорослей, так же как и карбоксисом у

цианобактерий [6–8]. В-третьих, накоплены многочисленные свидетельства в

пользу того, что пиреноиды микроводорослей и карбоксисомы цианобактерий

являются функциональными аналогами и важными компонентами СО2-

концентрирующего механизма (ССМ). Предполагается, что увеличение

концентрации СО2 осуществляется не во всем объеме клетки, а ограничено

карбоксисомами у цианобактерий [9] и пиреноидными комплексами у

эукариотических водорослей [1, 8, 10, 11]. Считается, что формирование CO2 в

этих компартментах катализируется карбоангидразой (КА) в непосредственной

близости от активных центров карбоксилирования Rubisco.
Присутствие КА в пиреноидах и карбоксисомах впервые было установлено в 1991

-92 гг. [5, 12] и впоследствии подтверждено с помощью иммунологических и

иммуноцитохимических методов [7, 13]. Показано, что формирование крахмальных

обкладок пиреноида происходит при индукции ССМ в ответ на снижение

концентрации СО2 [5, 10], что может снижать сопротивление диффузии СО2 из

пиреноида в строму.
В то же время, остается неясным, где локализуется КА в пиреноиде – в

матриксе или во внутрипиреноидных ламеллах тилакоидов. Наличие КА в

тилакоидах хлоропластов микроводорослей не вызывает сомнений [2, 14, 15].

Показано, что КА Cah3 является белком люмена [15] и ассоциирована с

комплексом ФС II [16–20].
Таким образом, пока не получено однозначного ответа на вопросы о топологии

Cah3 в хлоропласте микроводорослей, участии пиреноида в функционировании ССМ

эукариотических фотосинтезирующих организмов и роли этого микрокомпартмента

в осуществлении и регуляции темновой стадии фотосинтеза.
Целью настоящей работы являлось исследование распределения Cah3 в тилакоидах

стромы и пиреноида, что чрезвычайно важно для понимания функционирования ССМ

в хлоропласте.

МЕТОДИКА

Штаммы и условия выращивания. В опытах использовали клетки Chlamydomonas

reinhardtii 137K+ дикого типа (контроль) и мутантов, полученных методом

ступенчатого экспериментального мутагенеза Ладыгиным [21]. В работе

использовали мутанты C. reinhardtii, лишенные реакционных центров ФС II (А-

110-14) или ССК ФС II (С-48). Водоросли культивировали в чашках Петри на

ацетатной агаризованной среде при температуре 23ºС и освещенности 4 Вт/м2

[21]. В этих условиях насыщающей является освещенность 6 Вт/м2.
В качестве объектов исследования также использовали штамм С. reinhardtii

137mt+ и полученные на его основе клетки ССМ-мутанта cia3 [22], которые были

подарены коллекции ИФР IPPAS проф. Moroney (США).
Водоросли выращивали в условиях интенсивной культуры при освещении 50 мкмоль

квантов света/(м2 c), 28ºС и постоянном барботировании суспензии газо-

воздушной смесью с 2% СО2. При исследовании адаптивных перестроек

концентрацию СО2 снижали на линейной стадии роста культур с 2 до 0.03%,

часть суспензии оставляли при 2% СО2. Через 48 ч после изменения содержания

СО2 в клетках дикого штамма и мутанта cia-3 определяли скорость фотосинтеза

и фотохимическую активность ФС II.
Фотосинтетические характеристики.
Скорость фотосинтетического выделения кислорода измеряли с помощью электрода

типа Кларка в 3.9 мл клеточной суспензии в 25 мМ KH2PO4–NaHPO4–фосфатном

буфере (pH 5.8) при 25ºС. Диоксид углерода удаляли из буфера путем

продувания его в течение суток воздухом, пропущенным через 1 М раствор КОН.

Реакцию начинали добавлением NaHCO3 [14].
Фотохимическую активность ФС II регистрировали с помощью флуориметра PAM

(“Walz”, Германия). Клетки (из расчета 3 мкг хлорофилла/мл) промывали MES–

KOH-буфером (pH 5.5), не содержавшим СО2, и выдерживали 5 мин в кювете в

темноте. Выход флуоресценции F0 определяли при интенсивности света 0.1

мкмоль/(м2 с). Значения максимальной флуоресценции Fm определяли при

освещении клеток (1 с) насыщающим белым светом интенсивностью 8000 мкмоль/

(м2 с). Фотохимическую эффективность ФС II оценивали как (1 – F/Fm) [17].
Иммунодетекция карбоангидразы. Электрофоретическое разделение полипептидов

проводили в денатурирующих условиях в 12% геле полиакриламида. Количество

нанесенного белка составляло 20 мкг на дорожку геля. Пробы солюбилизировали

нагреванием в течение 5 мин при 95ºС.
Вестерн-блот-анализ осуществляли, согласно протоколу Bio-Rad Laboratories, с

использованием стандартных реагентов. В качестве первичных антител

использовали афинно очищенные антитела против -КА (Cah3) из C. reinhardtii

[16], любезно предоставленные проф. Samuelsson (Швеция). В качестве

вторичных антител использовали анти-кроличьи антитела, меченные пероксидазой

хрена (“Amersham Life Science”). Специфическое связывание визуализировали,

используя хемолюминесцентные растворы (ECL, “Amersham Life Science”).
Иммуноэлектронная микроскопия. Для иммуноэлектронного анализа клетки C.

reinhardtii фиксировали в 4% формальдегиде, приготовленном в 0.1 М фосфатном

буфере (pH 7.2) при 4С в течение нескольких суток [3]. После троекратного

отмывания образцов в том же буфере материал обезвоживали 70% этанолом и

заключали в смолу LR-White (“Sigma”). Срезы получали на микротоме LKB

(Швеция) при помощи стеклянного ножа и помещали их на никелевые сетки.
Далее использовали непрямой иммуноцитохимический метод. Каждую никелевую

сетку предварительно обрабатывали в течение 40 мин в капле (40 мкл) БСА в 50

мM фосфатном буфере (рН 7.4) с добавлением 0.85% NaCl (BSA–PBS) для

блокирования неспецифического взаимодействия антител. Затем сетки переносили

на 100 мкл капли с раствором первичных антител в BSA–PBS (1 : 20). В

качестве первичных антител использовали аффинно очищенные антитела к белку

Cah-3 (-КА). Сетки экспонировали 4 ч при комнатной температуре и затем 12 ч

во влажной камере при 4ºС. После нескольких промываний в BSA–PBS сетки

переносили на 100 мкл капли с раствором белка Protein-A-Gold в BSA–PBS (1 :

15) и экспонировали 1.5 ч при комнатной температуре. Затем сетки снова

промывали последовательно в BSA–PBS, PBS, деионизированной воде mQ.

Коллоидное золото было получено из Института биохимии и физиологии растений

и микроорганизмов РАН (размер 20 нм, А528 = 6.5).
Для контроля специфичности иммунохимических реакций часть срезов не

обрабатывали первичными антителами, но проводили реакцию с Protein-А-Gold

(контроль). Срезы анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе

JEM JEOL X-100 (Япония).
Определение хлорофилла и белка. Хлорофилл экстрагировали из клеток

микроводорослей метанолом и регистрировали спектры его поглощения с помощью

спектрофотометра МК-40 ("Carl Zeiss", Германия). Содержание белка определяли

по Лоури.
Опыты проводили в 2–3 биологических повторностях, биохимические параметры

определяли в 4–6 аналитических повторностях. В статье представлены данные

характерных опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Локализация КА
Исследование локализации КА среди полипептидов хлорофилл–белковых комплексов

фотосистем C. reinhardtii проводили методом вестерн-блот-анализа с

использованием антител к Cah3 белку (-КА) из С. reinhardtii. У мутанта А-

110-14, лишенного реакционного центра ФС II, не обнаружили кросс-реакции с

антителами к Cah3 в отличие от мутанта, лишенного ССК ФС II (рис. 1а).

Иммуноблоттинг полипептидов фотосинтетических мутантов с использованием

антител к маркерам ФС II (D1, 33 кД) выявил отсутствие реакционного центра

ФС II только у мутанта А-110-14 (рис. 1б, 1в). Эти данные показывают, что

Cah3 ассоциирована с реакционным центром ФС II (КА–ФС II) и не связана с ССК

ФС II.

Фотосинтетическое выделение О2
Углекислотные кривые фотосинтетического выделения О2 измеряли в клетках

дикого типа C. reinhardtii (WT) и мутанта сia3, лишенного активной формы

Cah3, которые были выращены при различных концентрациях СО2 в среде

культивирования. Скорость выделения кислорода у клеток дикого типа,

выращенных при атмосферной концентрации СО2 (0.03%), была значительно выше

по сравнению с клетками, выращенными при высоком (2%) содержании СО2,

особенно в области низких концентраций неорганического углерода (Сi) в среде

измерения (рис. 2). Таким образом, при недостатке СО2 в клетках наблюдали

увеличение фотосинтетического сродства к Сi, что, как известно, является

результатом физиологической экспрессии механизма СО2-концентрирования (ССМ).

В клетках мутанта cia3 не наблюдали изменений сродства к Сi при изменении

условий обеспечения клеток диоксидом углерода в ходе культивирования. При

этом скорость фотосинтетического выделения кислорода клетками, выращенными

при недостатке СО2, у мутанта была значительно ниже по сравнению с клетками

дикого типа.

Фотохимическая эффективность ФС II

Фотохимическая эффективность ФС II в клетках C. reinhardtii дикого типа

также зависела от условий выращивания и изменялась при изменении

концентрации Сi в среде измерения. При добавлении в измерительную ячейку

бикарбоната в низких концентрациях активность ФС II у клеток дикого типа,

выращенных при низкой концентрации СО2, значительно повышалась по сравнению

с клетками, выращенными при высокой концентрации СО2 (рис. 3). При

концентрациях бикарбоната выше 0.5 мМ эти различия нивелировались. У

мутанта, лишенного Cah3 (КА-ФС II), фотохимическая эффективность ФС II была

ниже по сравнению с диким типом, особенно в клетках, выращенных при

недостатке СО2.

Ультраструктура хлоропласта Chlamydomonas

Клетки C. reinhardtii имеют чашевидный хлоропласт, в базальной части

которого находится пиреноид, окруженный крахмальной обкладкой. Пачки

хлоропластных тилакоидов располагаются параллельно оболочке хлоропласта,

некоторые из тилакоидов проходят между зернами крахмала и входят в пиреноид

(рис. 4).
По данным Griffiths [23], у C. reinhardtii, как и у большинства зеленых

водорослей, наблюдается редукция структуры тилакоидов, входящих в пиреноид –

их число в пачке уменьшается до 1–2, в то время как хлоропластные пачки

состоят из 2–8 тилакоидов. В связи со спецификой фиксации материала (для его

дальнейшей иммунохимической обработки, исключающей применение осмия),

невозможно получить снимки с высоким разрешением, позволяющим оценить тонкую

структуру тилакоидов. На рис. 4 структура тилакоидов хлоропласта видна

хорошо, тогда как подготовленные для иммунной реакции срезы не позволили

визуализировать тилакоиды пиреноида. Тилакоиды, пpонизывая белковый матрикс

пиреноида, образуют трубки, что хорошо видно на ультратонких срезах при

бóльшем увеличении на рис. 5. “Трубки” имеют различное сечение (рис. 5а, 5б)

и расположены хаотично, поэтому на одном срезе можно видеть трубки в

продольном и в поперечном расположении (рис. 5в, 5г). Пронизывая пиреноид в

разных направлениях, тилакоиды образуют внутри его тела густую сеть,

сохраняя связь с тилакоидами хлоропласта через входящие в пиреноид тилакоиды

(рис. 5б, 5г). Гранулы крахмала отделены от ламеллярного материала тонким

слоем хлоропластного матрикса, который окружает гранулы, осуществляя контакт

с телом пиреноида (рис. 5а, 5г). Пиреноид C. reinhardtii представляется

сферическим электронно-плотным включением в хлоропласте (рис. 4, рис. 5а–

5в), в делящейся клетке форма пиреноида может меняться (рис. 5г).
В опытных вариантах иммуноэлектронно-плотная метка (коллоидное золото)

обнаруживалась в хлоропласте, а именно: она была приурочена к

внутрипиреноидным тилакоидам и, в меньшей степени, к тилакоидам хлоропласта

(рис. 4а). В строме хлоропласта метка практически не обнаруживалась. В

других компартментах клетки метка также иногда обнаруживалась, но очень

редко и в очень незначительных количествах, что характерно для

неспецифического связывания иммунной сыворотки (рис. 4).
В клетках контрольных вариантов, где была пропущена ступень инкубации

материала с иммунной сывороткой и, таким образом, не произошло

специфического связывания комплекса Protein-A-Gold с антителами Cah3,

наблюдали лишь единичные частички коллоидного золота, не приуроченные к

каким-либо компартментам клетки (рис. 4б).
При анализе большого количества электронно-микроскопических фотографий можно

заключить, что метка в большей степени связывается с внутрипиреноидными

тилакоидами, по сравнению с тилакоидами хлоропласта, т.е. внутриклеточная

локализация специфической иммуноэлектронно-плотной метки свидетельствует о

присутствии тилакоидной Cah3 преимущественно в тилакоидах пиреноида. Таким

образом, принимая во внимание, что Rubisco также локализована, главным

образом, в пиреноиде водорослей [3, 5], можно говорить о ко-локализации

Rubisco и Cah3 у C. reinhardtii.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования организации ССМ с помощью мутантов, утративших способность

расти при низких концентрациях СО2, показали, что элементами (участниками)

ССМ являются ферменты КА и активный транспорт неорганического углерода (Сi).

Мутант cia3 относится именно к таким ССМ-мутантам, нуждающимся в высокой

концентрации СО2 в среде для своего роста (high CO2 required mutant) [22,

24]. Как видно из рис. 2, при недостатке СО2 интенсивность фотосинтеза у

этого мутанта значительно падает по сравнению с клетками дикого типа.

Известно, что cia3 имеет дефект в гене сah3, кодирующем тилакоидную

карбоангидразу [16]. Сиквенс сah3 кДНК показал, что полипептид относится к

α-КА и, вероятно, локализован в люмене тилакоидной мембраны хлоропласта C.

reinhardtii [16]. С помощью препаративного разделения фотосистем было

показано, что этот белок ассоциирован с ФС II [17, 20, 25] и связан с

реакционным центром, но не с ССК ФС II [19]. В настоящей работе эти

результаты нашли подтверждение в опытах с применением фотосинтетических

мутантов, лишенных отдельных хлорофилл–белковых комплексов (рис. 1).

Отсутствие Cah3 у мутанта cia3 вызывает подавление активности ФС II,

особенно при низком уровне СО2 (рис. 3), что было показано и в других

исследованиях [15, 19, 20].
Физиологическая функция люменальной Cah3 пока остается неясной.

Предполагается, что этот фермент может быть ключевым компонентом ССМ

хлоропласта [2, 11, 14, 17, 20] или может вовлекаться в регуляцию транспорта

электрона через контроль активности ФС II [19].
Первая функция была впервые предложена нами в 1993 г. [2, 14] и представлена

на рис. 6. Поглощенный клеткой Ci накапливается в виде НСО3– в строме

хлоропластов, где, как правило, наблюдается слабощелочной рН около 8.0. Это

приводит к накоплению пула бикарбоната и позволяет существенно снизить риск

спонтанных утечек CО2 из клетки. Поскольку формы Сi, в которых он

накапливается и фиксируется в клетке, различаются, возникает задача

преобразования высокого пула НСО3– в СО2 для реакции карбоксилирования и

образования органических соединений углерода. Эта реакция может быть

осуществлена только в “кислых” компартментах клетки и при условии тесной

кооперации КА и Rubisco. Мы полагаем, что таким компартментом может быть

пиреноид, содержащий Rubisco, в ламеллах которого найдена преимущественная

локализация Cah3 (рис. 4 и 5). Таким образом, основным компартментом, в

котором происходит высвобождение СО2 из пула НСО3–, является не весь

пиреноид, а только люмен внутрипиреноидных тилакоидов, имеющий кислый рН.

Согласно предложенному нами механизму (рис. 6), пиреноид выступает как

самостоятельный метаболический микрокомпартмент, в котором Cah3 играет

ключевую роль в образовании и концентрировании СО2 для Rubisco, что может

вносить существенный вклад в увеличение эффективности фотосинтеза. Эта

гипотеза получила теоретическую поддержку [11] и широкое обсуждение [8, 9,

15, 20, 24].
В поддержку этой гипотезы свидетельствует также ряд косвенных данных. В

работе Morita с соавт. [26] при исследовании нескольких видов Chlamydomonas

и Chloromonas показано, что способность клеток накапливать внутриклеточный

пул Ci зависит от формы пиреноидов. Наибольшие значения внутриклеточного

пула Ci (150–250 мкM) обнаружили у видов со сферическим электронно-плотным

пиреноидом, таким как у исследованной нами микроводоросли (рис. 4 и 5) с

высокой концентрацией Rubisco. Пиреноиды часто окружены крахмальным чехлом,

толщина которого увеличивается в течение акклиматизации к низким

концентрациям CO2 [5]. Функция этого чехла в CCM остается неясной. Показано,

что отсутствие крахмальной оболочки в дефектных по этому признаку мутантах

Chlorella и Chlamydomonas не препятствует их CCM активности [9]. Таким

образом, гипотеза о роли крахмального чехла как барьера утечки СО2 пока не

подтвердилась.
В 2004 г. исследовательской группой под руководством Moroney [27] у C.

reinhardtii была идентифицирована новая стромальная КА – Cah6,

локализованная во внепиреноидной области. Экспрессия Cah6 конститутивна и

немного повышается при низких концентрациях СО2. Предполагается, что Cah6

играет косвенную роль в ССМ, улавливая углекислоту, диффундирующую из

пиреноида – места локализации Rubisco, и конвертируя ее в НСО3–. Это

превращение увеличивает пул НСО3– в строме, сохраняя Сi внутри хлоропласта.
Наличие некоторого количества Cah3 в ламеллах стромы может указывать на

участие КА-ФС II также и в регуляции собственно фотосинтетических реакций. В

статье Villarejo с соавт. [19] было проведено сравнение функциональных

свойств ФС II клеток дикого типа и мутанта cia3, лишенного Cah3. Было

показано, что ФС II мутанта характеризуется низкой эффективностью работы,

что связано с повреждением на донорной стороне, которое устраняется при

добавлении бикарбоната. Авторы пришли к выводу о непосредственном участии

Cah3 в работе водоокисляющего комплекса. Они связывали это с участием Cah3 в

поставке ионов бикарбоната к донорной стороне ФС II, что обеспечивает

стабильность марганцевого кластера и эффективное протекание процесса

транспорта электронов от водоокисляющего комплекса на реакционный центр.

Однако, на наш взгляд, эта функция Cah3 маловероятна, если учесть, что

фермент локализован в люмене, и при кислом рН этого компартмента будет

катализировать дегидратацию бикарбоната. Позже этой группой ученых [28] было

установлено, что механизм участия Cah3 в оптимизации функции окисления воды

связан с ускорением отвода протонов, выделяющихся в результате реакции

окисления воды, за счет катализируемой этим ферментом реакции дегидратации

бикарбоната. Известно, что при высокой интенсивности света высокая скорость

выделения протонов приводит к локальному закислению люмена и, как следствие,

к повреждению водоокисляющего комплекса и выходу марганца [29, 30].
Таким образом, люменная КА Cah3, катализируя при свойственном этому

микрокомпартменту кислом значении рН реакцию:
Н+ + НСО3–          Н2О + СО2,
может участвовать в образовании молекул диоксида углерода для Rubisco в

пиреноиде, а также может быть ключевым компонентом водоокисляющего комплекса

ФС II в тилакоидах хлоропласта в строме, защищая его от избытка протонов

(рис. 6).
Авторы выражают благодарность докт. биол. наук В.Г. Ладыгину (Институт

фундаментальных проблем биологии РАН) за любезно предоставленные

фотосинтетические мутанты C. reinhardtii; проф. J. Moroney (Louisiana State

University, США) за штамм С. reinhardtii 137mt+ и ССМ-мутант cia3, которые

были подарены коллекции Института физиологии растений IPPAS; проф. G.

Sumuelsson (Umea University, Швеция) за предоставленные антитела Cаh3 и

обсуждение полученных результатов.
Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных

исследований (грант № 07-04-01480) и гранта президента Российской Федерации

для государственной поддержки молодых ученых (МК-1638.2007.4).
 Подписи к рисункам
Рис. 1. Вестерн-блот-анализ суммарных белковых фракций в клетках C.

reinhardtii дикого типа и фотосинтетических мутантов.
В реакции иммунодетекции использовали 20 мкг белка суммарного гомогената и

антитела к α-КА (Cah3), D1, 33 кД белкам C. reinhardtii. Мутанты лишены

только реакционного центра (1) или ССК ФС II (2); 3 – клетки дикого типа.

Рис. 2. Фотосинтетическое выделение кислорода в клетках C. reinhardtii

дикого типа (1, 2) и сia3 мутанта (3, 4), выращенных при 2% (1, 3) и при

0.03% СО2 (2, 4).

Рис. 3. Эффективность работы ФС II в клетках C. reinhardtii дикого типа (1,

2) и сia3 мутанта (3, 4), выращенных при 2% (1, 3) и при 0.03% СО2 (2, 4).

Рис. 4. Иммуноцитохимическая локализация Cah3 на срезах клеток C.

reinhardtii. Использовали антитела против Cah3 C. reinhardtii и Protein-A-

Gold (а). В контрольном варианте клетки были обработаны только Protein-A-

Gold (б).
СХ – строма хлоропласта, П – пиреноид, КО – крахмальная обкладка, ТП –

тилакоиды пиреноида, ТХ – тилакоиды хлоропласта, ОХ – оболочка хлоропласта,

ОК – оболочка клетки, Мх – митохондрия, ВТ – вхождение хлоропластных

тилакоидов в пиреноид.
Стрелкой ↑ показаны частицы коллоидного золота, приуроченные к тилакоидам

пиреноида, стрелкой  – частицы коллоидного золота, приуроченные к

тилакоидам хлоропласта.

Рис. 5. Иммуноцитохимическая локализация Cah3 на срезах через пиреноид C.

reinhardtii.
Обозначения те же, что на рис. 4.

Рис. 6. Схема возможного механизма генерации СО2 в пиреноиде с участием Cah3

и взаимодействия СО2-концентрирующей и О2-выделяющей систем хлоропласта.
 
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


1. Пронина Н.А., Семененко В.Е. Роль пиреноида в концентрировании, генерации

и фиксации CO2 в хлоропласте микроводорослей // Физиология растений. 1992.

Т. 39. С. 723-732.
2. Pronina N.A., Borodin V.V. CO2 Stress and CO2 Concentration Mechanism:

Investigation by Means of Photosystem-Deficient and Carbonic Anhydrase-

Deficient Mutants of Chlamydomonas reinhardtii // Photosynthetica. 1993. V.

28. P. 515-522.
3. Маркелова А.Г., Владимирова М.Г., Семененко В.Е. Ультраструктурная

локализация РБФК в клетках водорослей // Физиология растений. 1990. T. 37.

C. 907-911.
4. Константинова И.А., Болдина О.Н. Сравнительный анализ ультраструктуры

пиреноидов зеленых монадных и коккоидных водорослей // Физиология растений.

2000. Т. 47. С. 655-659.
5. Kuchitsu K., Tsuzuki M., Miyachi S. Polypeptide Composition and Enzyme

Activities of the Pyrenoid and Its Regulation by CO2 Concentration in

Unicellular Green Algae // Can. J. Bot. 1991. V. 69. P. 1062-1069.
6. Rawat M., Henk M.C., Lavigne L.L., Moroney J.V. Chlamydomonas reinhardtii

Mutants without Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase-Oxygenase Lack a

Detectable Pyrenoid // Planta. 1996. V. 198. P. 263-270.
7. Moroney J.V., Chen Z.Y. The Role of the Chloroplast in Inorganic Carbon

Uptake by Eukaryotic Algae // Can. J. Bot. 1998. V. 76. P. 1025-1034.
8. Badger M.R., Spalding M.H. CO2 Acquisition, Concentration and Fixation in

Cyanobacteria and Algae // Photosynthesis: Physiology and Metabolism / Eds

Leegood R.C., Sharkey T.D., von Caemmerer S. Dordrecht: Kluwer, 2000. P.

369-397.
9. Kaplan A., Reinhold L. CO2 Concentrating Mechanism in Photosynthetic

Microorganisms // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P.

539-570.
10. McKay R.M.L., Gibbs S.P. Composition and Function of Pyrenoids:

Cytochemical and Immunocytochemical Approaches // Can. J. Bot. 1991. V. 69.

P. 1040-1052.
11. Raven J.A. CO2 Concentrating Mechanisms: A Role for Thylakoid Lumen

Acidification? // Plant Cell Environ. 1997. V. 20. P. 147-154.
12. Price G.D., Coleman J.R., Badger М.R. Association of Carbonic Anhydrase

Activity with Carboxysomes Isolated from the Cyanobacterium Synechococcus

PCC7942 // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 784-793.
13. So А.К., Espie G.S. Cloning, Characterization and Expression of Carbonic

Anhydrase from the Cyanobacterium Synechocystis PCC6803 // Plant Моl. Biol.

1998. V. 37. P. 205-215.
14. Pronina N.A., Semenenko V.E. Membrane-Bound Carbonic Anhydrase Takes

Part in CO2 Concentration in Algal Cells // Current Research in

Photosynthesis / Ed. Baltscheffski M. Boston; London: Kluwer, 1990. P. 498-

502.
15. van Hunnik E., Sultemeyer D. A Possible Role for Carbonic Anhydrase in

the Lumen of Chloroplast Thylakoids in Green Algae // Funct. Plant Biol.

2002. V. 29. P. 243-249.
16. Karlsson J., Clarke A.K., Chen Z.Y., Hugghin, S.Y., Par, Y.I., Husic

H.D., Moroney J.V., Samuelsson G. A Novel Alpha-Type Carbonic Anhydrase

Associated with the Thylakoid Membrane in Chlamydomonas reinhardtii Is

Required at Ambient CO2 // EMBO J. 1998. V. 17. P. 1208-1216.
17. Park Y.I., Karlsson J., Rojdestvenski I., Pronina N., Klimov V., Oquist

G., Samuelsson G. Role of a Novel Photosystem II-Associated Carbonic

Anhydrase in Photosynthetic Carbon Assimilation in Chlamydomonas reinhardti

// FEBS Lett. 1999. V. 444. P. 102-105.
18. Пронина Н.А., Жила Н.М., Семененко В.Е. Две формы карбоангидразы в

клетках Dunaliella salina: выделение и свойства // Физиология растений.

1999. Т. 46. С. 74-81.
19. Villarejo A., Shutova T., Moskvin O., Forssen M., Klimov V.V.,

Samuelsson G. A Photosystem II-Associated Carbonic Anhydrase Regulates the

Efficiency of Photosynthetic Oxygen Evolution // EMBO J. 2002. V. 21. P.

1930-1938.
20. Hanson D.T., Franklin L.A., Samuelsson G., Badger M.R. The Chlamydomonas

reinhardtii cia3 Mutant Lacking a Thylakoid Lumen-Localized Carbonic

Anhydrase Is Limited by Supply to Rubisco and Not Photosystem II Function In

Vivo // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 2267-2275.
21. Ладыгин В.Г. Структурно-функциональная организация фотосистем в

хлоропластах Chlamydomonas reinhardtii // Физиология растений. 1998. Т. 45.

С. 741-762.
22. Moroney J.V., Husic H.D., Tolbert N.E., Kitayama M., Manuel L.J.,

Togasaki R.K. Isolation and Characterization of a Mutant of Chlamydomonas

reinhardtii Deficient in the CO2 Concentration Mechanism // Plant Physiol.

1989. V. 89. P. 897-903.
23. Griffiths D.J. The Pyrenoid // Bot. Rev. 1970. V. 36. P. 29-58.
24. Moroney J.V., Bartlett S.G., Samuelsson G. Carbonic Anhydrase in Plants

and Algae // Plant Cell Environ. 2001. V. 24. P. 141-153.
25. Van Hunnik E., Livne A., Pogenberg V., Spijkerman A.E., van den Ende H.,

Mendoza E.G., Sultemeyer D., Leeuw J.V. Identification and Localization of

Thylakoid-Bound Carbonic Anhydrase from Green Algae Tetraedron minimum

(Chlorophyta) and Chlamydomonas noctigata (Chlorophyta) // Planta. 2001. V.

212. P. 454-459.
26. Morita E., Abe T., Tsuzuki M., Fujiwana S., Sato N. Role of Pyrenoids in

the CO2-Concentrating Mechanism: Comparative Morphology, Physiology and

Molecular Phylogenetic Analysis of Closely Related Strains of Chlamydomonas

and Chloromonas // Planta. 2000. V. 208. P. 365-372.
27. Mitra M., Lato S.M., Ynalvez R.A., Xiao Y., Moroney, J.V. Identification

of a New Chloroplast Carbonic Anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii //

Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 173-182.
28. Shutova T., Kenneweg H., Buchta J., Nikitina J., Terentyev V.,

Chernyshov S., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Dau H., Samuelsson G. The

Photosystem II-Associated Cah3 in Chlamydomonas Enhance the O2 Evolution

Rate by Proton Removal // EMBO J. 2008. V. 27. P. 782-791.
29. Virgin I., Styring S., Andersson B. Photosystem II Disorganization and

Manganese Release after Photoinhibition of Isolated Spinach Thylakoid

Membranes // FEBS Lett. 1988. V. 233. P. 408-412.
30. Kramer D.M., Sacksteder C.A. How Acidic Is the Lumen? // Photosynth.

Res. 1999. V. 60. P. 151-163.